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細胞凍存與復蘇注意事項
  • 更新日期:2024-01-24      瀏覽次數(shù):296
    • 細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,利用凍存技術將細胞冷凍保存在-196℃液氮中,可以使細胞暫時停止生長并保留細胞特性,以便在需要時再復蘇細胞用于實驗。同時保存適量的細胞,可以防止細胞在培養(yǎng)過程中因受到污染或其他意外事件導致細胞丟種,起到細胞保種的作用。


      一、冷凍“慢條斯理",復蘇“眼疾手快"

      細胞凍存和復蘇采取“慢凍快融"的原則,慢速冷凍可使細胞內的水份滲出細胞外,減少細胞內形成冰晶的機會;快融以保證細胞外結晶快速融化,避免慢速融化水份滲入細胞內,再次形成胞內冰晶造成對細胞的損傷。


      二、“高高興興上班,平平安安回家"

      細胞凍存時需向培養(yǎng)基中加入冷凍保護劑,可保護細胞在冷凍時免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑可根據(jù)其是否穿透細胞膜分為滲透性和非滲透性兩類:

      1、滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內,一般是一些小分子物質,主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

      2、非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內,一般是些大分子物質,主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。


      三、細胞凍存的“按部就班"

      1、準備已滅菌的凍存培養(yǎng)液,并4℃預冷;

      2、選取對數(shù)生長期的細胞,棄掉細胞培養(yǎng)液,用細胞消化酶(如胰蛋白酶)進行消化,適時去掉消化液,加入少量新鮮培養(yǎng)液。懸浮生長的細胞不進行消化處理,直接將細胞收集于離心管中離心,1000 rpm,5-10 min;

      3、棄去上清液,逐漸加入適量預冷的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調節(jié)細胞濃度在5×106~1×107/mL之間;

      4、將上述細胞分裝于2 mL凍存管中,每管1-1.5 mL。在凍存管上標明細胞名稱、凍存日期和操作者;

      5、凍存:標準的降溫速率開始為-1~-2℃/ min,當溫度降到-80℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ,然后放入-80℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內。


      四、細胞復蘇的“按部就班"

      1、從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃水浴中,并不時搖動使其盡快融化;

      2、從37℃水浴中取出凍存管,在無菌條件下取出細胞,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻,以1000 rpm,5-10 min離心;

      3、棄去上清液,加入適量培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調整細胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);

      4、次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。


      五、前方高能預警

      1、配制好的細胞凍存液要進行預冷,新鮮配制的凍存液會產生大量的熱。

      2、凍存的細胞在半年后,建議取出一只凍存管細胞復蘇培養(yǎng),觀察生長情況,然后再繼續(xù)凍存。

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