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對于陽性對照品和陰性對照品您了解多少?
  • 更新日期:2023-07-18      瀏覽次數(shù):1178
    • 對于陽性對照品和陰性對照品您了解多少?

      陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有效性的控制品,同時也作為判斷結果的對照,因此對照品,特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定,對照品最好也為人血清,因為正常人血清在各種ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到,國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿為原料,即在血漿中加入鈣離子,使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固,除去凝塊后所得的液體,其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測,確定其中不含待測物質(zhì)。例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質(zhì),其中加入一定量的待檢物質(zhì),此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱,在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較,可對標本中受檢物質(zhì)的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml,陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑,以利保存。


      包被用抗體

      包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性,可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)(即便是極微量的),在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體,必須除去(可用吸收法)后才能用于ELISA,以保證試驗的特異性??寡宀荒苤苯佑糜诎?,應先提取IgG,通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被,高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性,則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高,特異性亦較強,因此不需要作吸收和親和層析處理,一般可將腹水作適當稀釋后直接包被,必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意,一種單抗僅針對一種抗原決定簇,在某些情況下,用多種單抗混合包被,可取得更好的效果。


      包被的條件

      包被用抗原或抗體的濃度,包被的溫度和時間,包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質(zhì)而選定??贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液,也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置過夜,37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化,每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。


      包被的方式

      將抗原或抗體固定在過程稱為包被。換言之,包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質(zhì)與聚苯乙x固相載體是通過物理吸附結合的,靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的,受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙x等固相具有較強的吸附力,其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上,抗體結合點暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時,抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露,在這種情況下,直接包被效果不佳,可以采用間接的捕獲包被法,即先將針對該抗原的特異抗體作預包被,其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面,其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用,包被在固相上的抗原純度大大提高,因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法,試驗的特異性、敏感性均由此得以改善,重復性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少,僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙x載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如,在檢測抗DNA抗體時,需用DNA作為包被抗原,而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合??蓪⒕郾揭襵先經(jīng)紫外線照射,以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì),如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被,也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被,即用親和素先包被載體,然后加入生物素化的DNA,這種包被方法均勻、牢固,已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

      脂類物質(zhì)無法與固相載體結合,可將其在有機溶劑中溶解后加入ELISA板孔中,開蓋置冰箱過夜或冷風吹干,待酒精揮發(fā)后,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面??剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。


      洗板方法:

      1.手工洗板方法:吸去或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。

      2.自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。待檢樣本:體液、血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液、尿液、組織勻漿、心房水標本等。

      陽性對照品上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術相關產(chǎn)品,勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務質(zhì)量"的方針。

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