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科研人如何正確制備細胞周期實驗樣品
  • 更新日期:2023-03-31      瀏覽次數(shù):607
    • 細胞周期分析是分子生物學常用的實驗方法,尤其在抗腫瘤藥物研究上使用普遍。但細節(jié)若是處理不好,做得再多也做不出正確的、好看的分布圖。如何準確制備細胞周期測試的樣品,科研實驗行業(yè)的小伙伴們一起來了解下!




      先簡單介紹下實驗原理

      碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,可以與 DNA 和 RNA 結合,但其不能透過正常的細胞膜,所以對活細胞無染色作用。可通過冷乙醇或其他破膜劑的作用,使細胞膜通透性增加。PI 進入細胞內后,選擇性地與核酸結合,RNase 裂解 RNA 后,細胞內染料的熒光量與細胞核內的 DNA 含量成正比。通過流式細胞儀檢測單個細胞熒光強度得到相對 DNA 含量,根據(jù)各個時相 DNA 含量不同,將細胞分為不同的周期。

      具體操作流程及注意事項

      1、將對數(shù)期的細胞接種于 6 孔板中(2×105 個 / 孔,根據(jù)細胞大小、增值速度適當調整),每孔加 2 ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

      2、細胞貼壁后(根據(jù)細胞具體情況),去除培養(yǎng)基,分別加入培養(yǎng)基配置的不同濃度藥物 1 ml 孵育(不使用造成細胞大量死亡的藥物濃度和孵育時間)。

      3、藥物作用結束后,收集培養(yǎng)液,1500 rpm,離心 4 min。一定要一并收集漂浮的死細胞,不然會嚴重影響結果。

      4、消化收取貼壁細胞,吹打過程一應要輕柔充分,避免細胞受損、細胞黏連;離心轉速為 2000 rpm,離心 4 min(離心轉速不要超過 2000 rpm,也可以采用 1000 rpm,離心 5 min),PBS 洗 3 遍,以去除培養(yǎng)基、藥物殘留及細胞碎片。合并培養(yǎng)液和貼壁細胞。

      5、細胞沉淀中加入少量 PBS,輕柔充分重懸細胞。然后將重懸的細胞加入到 4℃ 預冷的 70% 冰乙醇中固定,輕輕吹打均勻(切記?。?!不要將冰乙醇加入到細胞中,這樣會造成細胞黏連,嚴重影響結果),封口膜封口,4℃ 過夜。

      6、2000 rpm 離心 4 min,吸去固定液,PBS 洗兩次,以去除固定液。

      7、細胞中加入含 PI(50 μg/ml)、RNaseA(50 μg/ml,去除 RNA)和曲拉通(1%,通透細胞膜)的工作液 200 μl(曲拉通粘性大,配置時一定要渦旋,保證混合均勻),室溫避光孵育 30 min。按照步驟 1 中的鋪板細胞數(shù),這個體積的工作液可以保證測試時的細胞濃度正合適。

      8、流式細胞儀檢測細胞周期。染色后,可以使用 PBS 去除染液,也可選擇不處理,親測沒有影響。

      9、FlowJo 軟件分析細胞周期時相分布。


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      整個過程一定要盡量降低操作對細胞的損傷,要吹打輕柔,減少離心次數(shù),轉速不要超過 2000 rpm。

      消化細胞時要保證細胞吹散,不要有細胞黏連,一旦這一步驟沒有消化充分,后面很難再將細胞吹散,后果嚴重。

      測試時細胞濃度一定要根據(jù)流式細胞儀的檢測范圍,不然可能會影響準確度。

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